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enero 8 , 2019 / Posted by acquacannabis / Noticias / No Comments

Diferenciación de cannabis farmacológico y no farmacológico mediante un ensayo de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

Departamento de Química, Universidad de Auckland, Bolsa privada 92019, Auckland 1142, Nueva Zelanda b Instituto de Investigación y Ciencia Ambiental, Bolsa privada 92021, Auckland 1047, Nueva Zelanda
Cannabis sativa es una droga ilegal y un cultivo legítimo. La diferenciación entre el cannabis de drogas ilegales y las formas de cannabis no farmacológicas es relevante en el contexto del crecimiento de las variedades de cannabis de fi nales y semillas para fines comerciales. Esta diferenciación se determina actualmente en base a los niveles de tetrahidrocannabinol (THC) en plantas adultas. Los métodos basados ​​en el ADN tienen el potencial de analizar el material de cannabis inadecuado para el análisis utilizando medios convencionales que incluyen semillas, polen y material severamente degradado. El propósito de esta investigación fue desarrollar un ensayo de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) para la diferenciación de plantas de cannabis con «medicamentos» y «sin medicamentos». Se desarrolló un ensayo basado en cuatro polimorfismos dentro de un fragmento de 399 pb del gen de la sintasa del ácido tetrahidrocannabinólico (THCA), utilizando el kit de multiplexación de instantáneas. Este ensayo de SNP se probó en 94 plantas de cannabis, que incluían 10 muestras ciegas, y fue capaz de diferenciar entre cannabis «fármaco» y «no farmacológico» en todos los casos, a la vez que se diferenciaba entre cannabis y otras especies. Se encontró que las plantas no farmacológicas eran homocigotas en los cuatro sitios analizados, mientras que las plantas de cannabis medicinales eran homocigotas o heterocigotas.

1. Introducción
Cannabis sativa es una de las drogas ilícitas de mayor prevalencia en el mundo, con un estimado de 143–190 millones de personas que consumen cannabis durante 2007 [1]. El valor del comercio ilícito de cannabis solo en Nueva Zelanda se ha estimado en NZ $ 131–190 millones por año [2,3]. Sin embargo, el cannabis también es un cultivo legal potencialmente valioso que puede cultivarse para la producción de fi bra, aceite de semilla y biorremediación [4–6]. La diferenciación entre el cannabis «no farmacológico» legítimo y el cannabis ilícito «droga» es una faceta importante de la regulación del crecimiento del cannabis como cultivo legal [7].
El tetrahidrocannabinol (THC) es el principal compuesto psicoactivo presente en Cannabis [8,9]. Hay una cantidad de cannabinoides adicionales en Cannabis, los principales componentes de cannabinoides incluyen cannabigerol (CBG), cannabidiol (CBD), cannabichromene (CBC) y cannabinol (CBN) [10-12]. El cannabis no farmacológico suele definirse en función del contenido de THC; por ejemplo, en la Unión Europea, el cáñamo debe tener un contenido de THC inferior al 0,2% [7]. En Nueva Zelanda, el requisito es que el contenido de THC sea inferior al 0,35% [13]. El contenido de cannabinoides puede verse afectado por la edad o el tamaño de la planta analizada y las condiciones ambientales en las que se cultivó, lo que a su vez puede afectar la determinación precisa del quimiotipo de Cannabis [11].
Aunque los métodos actualmente disponibles para la identificación del Cannabis farmacológico son confiables y bien establecidos [14], un análisis de ADN capaz de discriminar entre el Cannabis farmacológico y el no farmacológico tendría fortalezas adicionales. La principal de ellas es la identificación del Cannabis de drogas a partir de material inadecuado para el análisis utilizando ensayos convencionales para el contenido de THC. Esto puede incluir plantas juveniles, semillas, pequeños fragmentos de hojas, polen, material en descomposición, material parcialmente quemado y material de la raíz [15].


Varios estudios han desarrollado ensayos de ADN para identificar muestras de cannabis, sin distinguir entre el cannabis farmacológico y el no farmacológico [16-18]. Adicionalmente, de Meijer et al. [19] informaron una secuencia caracterizada por la región amplificada o marcador SCAR capaz de diferenciar entre Cannabis farmacológico y no farmacológico que se ha desarrollado a partir de un marcador de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) asociado con THC alto en Cannabis. Este marcador se asoció con el fenotipo THC / CBD en lugar de estar vinculado intrínsecamente a la síntesis de THC y no pudo clasificar de manera inequívoca todas las muestras analizadas [19].
La síntesis de THC en Cannabis implica la conversión de varios precursores por una serie de enzimas sintasas. El paso final en la síntesis de THC es la conversión de ácido cannabigerólico (CBGA) en ácido tetrahidrocannabinólico (THCA) catalizado por la enzima THCA sintasa [20,21]. THCA luego se descarboxila a THC [21]. Este proceso se refleja en la conversión de CBGA a ácido cannabidiolico (CBDA) y ácido cannabicroménico (CBCA) por CBDA sintasa y CBCA sintasa respectivamente, seguido de una subsiguiente descarboxilación al cannabidiol (CBD) y al cannabi-cromeno (CBC) [22,23] . Las cepas de drogas de Cannabis son típicamente altas
en THC. Las cepas de cannabis de aceite y fi bra están típicamente dominadas por el CBD y, ocasionalmente, el cannabigerol (CBG), la forma descarboxilada.
de CBGA [24]. El CBC se encuentra en niveles altos en plantas de cannabis juvenil y en cepas con un estado juvenil persistente [25].
Kojoma et al. [26] secuenciaron los genes THCA sintasa de seis fármacos y siete cepas de cannabis. La comparación de estas secuencias reveló dos formas distintas del gen de la THCA sintasa, una encontrada en las seis cepas farmacológicas y la otra encontrada en las siete cepas de fi bra. Hubo un total de 63 sustituciones de nucleótidos que diferenciaron las seis secuencias de la cepa del fármaco de las siete secuencias de la cepa de fi bra, que correspondían a 37 sustituciones de aminoácidos en el producto del gen de la THCA sintasa. Kojoma et al. [26] consideró que estas secuencias divergentes de THCA sintasa representan alelos que codifican una forma activa e inactiva de la enzima THCA sintasa.
Kojoma et al. describieron un conjunto de cebadores de PCR utilizados para amplificar un fragmento de 1,2 kb de la secuencia de la THCA sintasa activa propuesta que se encuentra en las seis cepas de fármacos [26]. Un fragmento de 1,4 kb del gen de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (rbcL) se amplificó como control positivo. El principal inconveniente de este marcador de THCA sintasa es la longitud del fragmento amplificado que puede hacer que la amplificación sea más difícil, particularmente de muestras degradadas, como las que pueden encontrarse en las escenas del crimen [27–30].
El objetivo de este estudio fue desarrollar un ensayo de polimorfismo de nucleótido único (SNP) más adecuado para las muestras de la escena del crimen capaz de discriminar entre variedades de cannabis THC alto y bajo en función de la variación de secuencia en el gen de la THCA sintasa y probar este ensayo en drogas y no – Drogas variedades de Cannabis.


2. Materiales y métodos
2.1. Diseño de imprimación
El ensayo SNP se diseñó basándose en el protocolo de extensión de base única (SBE) del kit de multiplexación ABa SNaPshotTM.
Se amplificó un fragmento de 399 pares de bases (pb) del gen de la THCA sintasa de Cannabis con y sin fármaco utilizando los cebadores C y E de Kojoma et al. [26] con dos modificaciones: se agregaron dos bases degeneradas al cebador C para explicar las diferencias entre las formas activa e inactiva de la secuencia de la THCA sintasa y la terminal T se eliminó del cebador E para acercar la temperatura de fusión a la del cebador C Estos cebadores modificados se conocen como C2 y E2 (Tabla 1). El cebador C2 se une a 738 pb desde el inicio de la secuencia de la THCA sintasa de 1653 pb, mientras que el cebador E2 (inverso) se ubica a 516 pb desde el final de la secuencia como se muestra en la Fig. 1.
Los cebadores de extensión se diseñaron para apuntar a cuatro polimorfismos no sinónimos dentro del gen THCA sintasa (Tabla 1). Las secuencias activas e inactivas de THCA sintasa de Kojoma et al. [26] se diferencian por 63 SNP que diferían en el estado entre las 6 cepas de tipo de fármaco y las 7 cepas no farmacológicas secuenciadas. La mayoría de las 63 diferencias de nucleótido único entre las formas activa e inactiva de la THCA sintasa no fueron adecuadas para su uso como marcadores para el fenotipo de THCA en base a la sinonimia, la similitud con el gen de la THCA sintasa estrechamente relacionado, la idoneidad de los sitios de enlace de cebado y las restricciones. en tamaño amplicon.
Los marcadores de SNP se seleccionaron en función de los siguientes criterios: (1) los SNP seleccionados no eran sinónimos (es decir, correspondían a diferencias de aminoácidos entre los productos de la proteína de la secuencia de THCA activos e inactivos); (2) el estado de nucleótido en la forma del fármaco no se compartió con el de la secuencia publicada del gen de la CBDA sintasa estrechamente relacionado; (3) se prefirieron las transversiones (C-A, C-G, T-A, T-G) a las transiciones (C-T, A-G); Dado que las transversiones son estadísticamente menos probables que ocurran [31], se considera que es menos probable una mutación posterior al estado original.

Fig. 1. Posición de unión de los cebadores SNP en el gen de la THCA sintasa.
Estos criterios dejaron un conjunto de 20 SNP para los cuales se consideraron las secuencias directa e inversa durante el diseño del cebador. Se seleccionaron cuatro cebadores SNP para ser utilizados en los análisis, los cuatro SNP tenían temperaturas de fusión inferiores a 18 a cada lado de 57 ° C, una separación de al menos cinco pares de bases de longitud entre cada cebador para facilitar el análisis.
Además de los requisitos establecidos anteriormente, los SNP seleccionados y sus sitios de unión a cebadores de extensión tuvieron que caer dentro de un único amplicón de PCR fácilmente amplificado. Un ensayo basado en la amplificación de todo el gen de la THCA sintasa se consideró poco práctico desde una perspectiva forense, ya que las muestras pueden ser de baja calidad con ADN potencialmente degradado. Los cuatro marcadores seleccionados para el ensayo final se incluyeron en el fragmento de 399 pb amplificado por los cebadores C y E de Kojoma et al. [26].
Los SNP 8F y 9F se analizaron con cebadores directos, los SNP 16R y 17R se analizaron con cebadores inversos.
SNP 17R es una transición ubicada a 887 pb desde el comienzo de la secuencia de la THCA sintasa. La forma activa o farmacológica del gen THCA sintasa transporta una adenina (A) en este locus, mientras que la forma inactiva porta una guanina (G). Como el cebador de extensión para este SNP es un cebador inverso, se incorpora una timina marcada roja (T) durante la reacción de mini-secuenciación para la forma activa de THCA sintasa y se incorpora una citosina marcada amarilla (C) para la forma inactiva de THCA sintetasa , dando lugar a un pico rojo para la forma activa de THCA sintasa y un pico amarillo, mostrado en negro durante el análisis, para la forma inactiva de THCA sintasa.
SNP 16R es una transversión a 953 pb; El polimorfismo es una adenina en la forma activa del gen de la THCA sintasa y una timina en la forma inactiva del gen de la THCA sintasa. Corresponde a un residuo de histidina en la forma activa de THCA sintasa y un residuo de leucina en la forma inactiva de THCA sintasa. Como el cebador de extensión para este SNP es un cebador inverso, se incorpora una timina marcada roja durante la mini reacción de secuenciación para la forma activa de THCA sintasa y se incorpora una adenina marcada verde para la forma inactiva de la THCA sintetasa, dando lugar a un rojo pico para la forma activa de THCA sintasa y un pico verde para la forma inactiva de THCA sintasa.
SNP 8F es una transversión a 1035 pb con una timina en la forma activa / fármaco y una guanina en la forma inactiva / no farmacológica, correspondiente a un residuo de fenilalanina en la forma activa y una tirosina en la forma inactiva. Como el cebador de extensión para este SNP es un cebador directo, se incorpora una timina marcada roja durante la mini reacción de secuenciación para la forma activa de THCA sintasa y una guanina marcada azul para la forma inactiva de THCA sintasa.
SNP 9F es una transversión a 1079 pb con una timina en la forma activa / farmacológica y una adenina en la forma inactiva / no farmacológica, correspondiente a un residuo de lisina en la forma activa y una arginina en la forma inactiva. Como el cebador de extensión para este SNP es un cebador directo, se incorpora una timina marcada roja durante la reacción de mini-secuenciación para la forma activa de THCA sintasa y una adenina marcada verde para la forma inactiva de THCA sintasa.

2.2. Coleccion de muestra
Se analizaron un total de 79 plantas de cannabis de tipo farmacológico y 15 plantas de cannabis no farmacológicas. Se analizaron cinco especies adicionales de plantas que no son cannabis para probar la amplificación potencial de especies cruzadas. Humulus lupulus (Common Hop), Celtis sinensis (Chinese Hackberry), Ficus macrophylla (Moreton Bay Fig) y Ulmus procera (English Elm) fueron seleccionados como parientes de Cannabis [32]. Nicotiana tabacum (tabaco cultivado) se seleccionó sobre la base de que se puede mezclar con Cannabis para el uso de drogas [33].
Las muestras de cannabis de tipo farmacológico se obtuvieron a partir de materiales incautados recibidos en el Instituto de Ciencia e Investigación Ambientales (ESR). Las muestras de cáñamo se obtuvieron del material enviado para las pruebas de cannabinoides en ESR, con permiso de los proveedores. Los niveles de THC se cuantificaron mediante cromatografía de gases por espectrometría de masas (GCMS) para todas las muestras de cáñamo y 51 de las 79 muestras de cannabis de tipo farmacológico recibidas.
Todas las muestras de cáñamo se confirmaron como menos del 0,35% de THC de acuerdo con la ley de Nueva Zelanda. Las concentraciones de THC en las muestras de fármacos oscilaron entre el 4,1% y el 18,15%, con un promedio del 10,7% de THC. Cuando la concentración de THC no se cuantificó, la presencia de THC se confirmó mediante cromatografía en capa fina (TLC).
Julia Wenzel proporcionó otras 11 muestras como muestras ciegas en el Instituto de Técnicas Técnicas Bundeskriminalamt (BKA) en Wiesbaden. El ADN de estas muestras se extrajo en Wiesbaden, Alemania y luego se envió a ESR en Auckland, Nueva Zelanda, donde se analizaron con los marcadores de SNP desarrollados.
2.3. Extracción y amplificación.
El ADN se extrajo del material vegetal seco utilizando el mini kit de plantas DNeasy1 (Qiagen # 69104) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación a la porción de ruptura de tejido del protocolo: las muestras se cortaron finamente con un bisturí y luego se trituraron en 2 ml. tubo con un micropestáculo Eppendorf (Eppendorf 0030 120.973) que utiliza un taladro inalámbrico de 19 V en presencia de 500 ml de tampón AP1 y 4 ml de RNAsa A.
Todo el termociclado se realizó en un termociclador Eppendorf epGradient S. La amplificación de la PCR se realizó mediante el uso de Sigma Extract-N-AmpTM PCR ReadyMixTM (Sigma-Aldrich # E3004). Los parámetros de PCR utilizados fueron los siguientes: 94 8C durante 5 min, luego 35 ciclos de: 94 8C durante 30 s, 65 8C durante 30 sy 72 8C durante 1 min. Esto fue seguido por una extensión final adicional de 72 8C durante 5 min. Los productos de la PCR se visualizaron junto a una escalera de 1 kb + (Invitrogen # 10787-018) en un gel de agarosa-TBE al 1.5% teñido con bromuro de etidio (Invitrogen # 15585-01).
Antes de la mini-secuenciación, se incubaron 10 ml de producto de PCR en un termociclador con 5 unidades de fosfatasa antártica (New England Biolabs # M0289S) y 2 unidades de exonucleasa I (New England Biolabs # M0293S) a 37 8C durante 30 minutos para eliminar la no incorporación. cebadores y dNTPs. Las enzimas se inactivaron luego calentando a 75ºC durante 15 min.
2.4. Minisecuenciación


Las reacciones de extensión del cebador SNP se realizaron utilizando 5 ml de la mezcla de reacción preparada multiplexada de SNaPshotTM (kit de multiplexión SNaPshotTM ABI Prism1 # 4323151), 4 ml de producto amplificado diluido a uno de cada diez con agua estéril y 1 ml de sellado de los cuatro cebadores de extensión que se muestran en la Tabla 1. Las concentraciones de cada cebador en la reacción final fueron 0.1 mM cebador 16R, 0.2 mM cebador 8F, 0.2 mM cebador 9F y 0.4 mM cebador 17R. Las reacciones de mini-secuenciación consistieron en 25 ciclos de: 10 s a 958, 5 s a 57.48 y 30 s a 608. Todos los cebadores de extensión se probaron individualmente antes de la amplificación múltiple.
Después de la reacción de minisecuenciación, los productos se incubaron en un termociclador durante 60 minutos a 37ºC con 1 unidad de fosfatasa antártica (New England Biolabs nº M0289S) para eliminar los nucleótidos marcados con fluoros no incorporados, seguidos de 15 minutos a 75ºC para inactivar la enzima. . El análisis de minisecuenciación se realizó en un analizador genético Applied Biosystems 3130, cargando 0,5 ml de producto de minisecuenciación con 0,25 ml de estándar de tamaño GeneScanTM 120 LIZ1 (ABI # 4324287) y 9,25 ml de Hi-DiTM Formamide (ABI # 4311320), los perfiles SNP se analizaron utilizando el escáner Peak v1.0TM (ABI # 4381867).
3. Resultados y discusión
3.1. Ampli fi cación
Un fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb fue exitosamente
amplificado en 94 muestras de cannabis utilizando los cebadores C2 y E2. No
se observaron productos de amplificación detectables de las otras cinco especies analizadas.
3.2. Minisecuenciación
Para los cuatro SNP seleccionados, los productos de extensión observados fueron, aproximadamente, de la longitud esperada. Las longitudes de producto de extensión esperadas fueron 1 pb más largas que las longitudes de cebador de extensión mostradas en la Tabla 1. Las longitudes de producto observadas fueron 1 a 2 pb más largas de lo esperado (Figs. 2 a 4). Es probable que esto se deba al efecto de los tintes fl uorescentes sobre la movilidad del ADN durante la electroforesis [34].
El análisis de las muestras de cannabis farmacológico y no farmacológico reveló tres genotipos SNP diferentes: plantas de cannabis homocigóticas para la forma activa de THCA sintasa (21 individuos, <0,4% THC), caracterizada por la presencia de productos de extensión activos de THCA sintetasa solamente (Fig. . 2), plantas de cannabis heterocigotas para las formas activas e inactivas del gen THCA sintasa (58 individuos, contenido promedio de THC del 10%, rango 4.1–14.9% THC) con productos de extensión de THCA sintasa activos e inactivos (Fig. 3) y plantas de Cannabis no farmacológicas homocigotas para la forma inactiva de THCA sintasa (15 individuos, contenido promedio de THC del 10,9%, rango 4,6–18,2%) con productos de extensión de THCA sintasa inactivos solamente (Fig. 4).
Se observó un producto de extensión adicional en todas las muestras investigadas con el múltiplex SNP. Con una longitud de 25 pb, este producto estaba cerca del tamaño esperado del producto de extensión obtenido usando el cebador de extensión 16R. El pico del electroferograma producido fue relativamente bajo y se marcó en amarillo indicando un nucleótido de citosina incorporado. Este producto de extensión no se observó durante los ensayos individuales de los cebadores de extensión SNP, pero se observó en reacciones de control negativo que involucran los cuatro cebadores de extensión (Fig. 5). Las alturas máximas (fl uorescencia) para este producto de extensión no variaron con la altura de los picos de diagnóstico. Como resultado de estas observaciones, se planteó la hipótesis de que el producto de extensión de 25 pb era un resultado de la interacción cebador-cebador en lugar de un producto de extensión del cebador 16R. Dado que los nucleótidos esperados de una muestra de Cannabis para este SNP son tiramina (roja) para la droga Cannabis o adenina (verde) para la droga no cannabis, la aparición de este pico no afecta la identificación precisa de la droga Cannabis.
3.3. Test ciego
Las 11 muestras ciegas proporcionadas por el Kriminaltechnisches Institut en Wiesbaden fueron asignadas supuestos fenotipos basados ​​en el medicamento Cannabis. Aunque el estudio presentado aquí es un estudio preliminar, se podría esperar que el ensayo desarrollado realice una valiosa contribución sujeta a una validación completa.
La mayoría de las muestras de Cannabis analizadas en este estudio resultaron ser heterocigotas para la forma activa del gen de la THCA sintasa, lo que indica que solo una copia única de la forma activa del gen de la THCA sintasa es necesaria para catalizar la conversión de CBGA a THCA. . El efecto de la heterocigosidad en el nivel de THCA sintetizado en la planta en relación con los niveles encontrados en plantas homocigotas para la forma activa de THCA es actualmente desconocido. La dificultad de separar la variación hereditaria en el contenido de cannabinoides de la variación ambiental [19,35] coloca este asunto fuera del alcance de este documento, aunque puede ser una vía útil para futuras investigaciones. Desde una perspectiva forense, la presencia de una copia de la forma activa del gen de la THCA sintasa parece identificar de manera confiable las plantas con un fenotipo de medicamento Cannabis.
Expresiones de gratitud
Robyn Sommerville y Vivienne Hassan, del grupo de drogas de ESR, por proporcionar muestras de cannabis para pruebas, Uwe Schleen-becker y Julia Wenzel del Bundeskriminalamt (BKA) Kriminaltechnisches Institut en Wiesbaden, Alemania, por proporcionar muestras para la prueba ciega. Jo Simons y Keith Bedford por comentarios útiles sobre el manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el fondo de desarrollo de capacidades del Instituto de Ciencia e Investigación Ambientales. David Rotherham también recibió el apoyo de una Beca de Doctorado de la Universidad de Auckland.
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